Создание «полезных» соединений не тождественно синтезу в кратчайшие сроки максимально простым путем большого количества новых веществ. «Полезные» библиотеки формируют с пониманием того, как их будут исследовать. При этом важно не только то, какой класс соединений получать и на какие виды активности их проверять, но и какую из версий комбинаторного синтеза (жидкофазный, твердофазный) выбрать, каков будет размер библиотеки, какие использовать носители, линкеры, каким образом распознавать соединения, если они находятся в смеси. Эти вопросы важны как для химиков, так и для фармакологов. Поэтому скрининг комбинаторных библиотек невозможен без тесного сотрудничества исследователей разных специальностей и в значительной мере повышает продуктивность их работы в поиске лидирующих структур.
Скрининг библиотек, полученных методами параллельного синтеза, т.е. тех, которые состоят из индивидуальных соединений, ничем не отличается от обычного высокоскоростного тестирования больших массивов веществ, получаемых в крупных фармацевтических компаниях. Преимущество состоит в том, что комбинаторные библиотеки легко интегрировать в уже существующие схемы оценки активности. Кроме того, эти исследования уже на самом начальном этапе могут быть количественными, т.к. используют индивидуальные соединения, а не смеси и, следовательно, о них можно получить значительно больше достоверной информации.
К недостаткам библиотек, полученных методами параллельного синтеза, следует отнести сравнительно малое количество соединений по отношению к mix-split- или random synthesis-библиотекам. Возможности высокоскоростного скрининга превышают возможности, предоставляемые «параллельной» библиотекой. Роботизация и миниатюризация технологии оценки активности в этом случае способны лишь ускорить фармакологическое тестирование БАВ. Важнейший аспект в оценке эффективности скрининга — способ детектирования результатов испытаний. Примером исследования с использованием сцинтилляционного метода распознавания активных соединений в библиотеке является схема, представленная на рис. 13.7. Если сцинтиллятор сцеплен с полимерным носителем, на который к тому же привита белковая молекула (рецептор), то при связывании такой мишени с меченым радиоактивной меткой лигандом возникает эмиссия. Ее легко регистрировать с помощью соответствующего датчика. Аналогичным образом могут быть устроены стенки или дно микроцилиндра, в котором расположена мишень — энзим. Такую кювету заполняют подходящим субстратом и добавляют исследуемое вещество — потенциальный ингибитор данного Ф. Если ингибитор препятствует взаимодействию Ф со своим субстратом, эмиссия отсутствует. В качестве источников р-частиц используют 125J, Скрининг соединений, иммобилизованных на полимерном носителе.
Методика оценки активности веществ, закрепленных на твердом носителе, — оп-Ьеаё-исследования — несколько отличается от рассмотренной выше. Обычно для распознавания активных веществ, иммобилизованных на полимерных гранулах, используют рецепторы, имеющие в своем составе флуоресцентные или радиоактивные метки. Такие рецепторы инкубируют с комбинаторной библиотекой. После интенсивной промывки гранулы с закрепленными веществами и связанными с ними рецепторами, отбирают методом флуоресцентной микроскопии или с помощью другого флуоресцентно чувствительного детектора. В качестве флуоресцентной метки широкое распространение получил GFT- флуоресцентный полипептид, впервые выделенный из медуз Aequoria victoria. Главное преимущество GFT-полипептида заключается в том, что это единственный белок, переходящий во флуоресцирующее состояние самопроизвольно без участия Ф или кофакторов. Он имеет относительно небольшую полипептидную цепь (238 аминокислотных остатков). Флуорофорный фрагмент расположен внутри жесткой p-цилиндрической структуры, что существенно снижает влияние на него окружающей среды. Обычно с помощью GFT-пептида модифицируют гены, экспрессию которых оценивают в ходе скрининга. Культуру клеток с модифицированными генами инкубируют с библиотекой тестируемых соединений и регистрируют интенсивность флуоресценции. Наличие таковой свидетельствует о способности отдельных соединений из испытуемого массива оказывать влияние на экспрессию генов определенного типа, что и является критерием активности исследуемых БАВ. Следует подчеркнуть, что on-bead-исследования в большинстве случаев рассматривают.
Добавить комментарий