Регуляция активности Ф может осуществляться различными способами: ковалентной модификацией, активацией зимогена, ингибированием, а также за счет кооперативных и аллосгерических эффектов. Ковалентной модификацией называется присоединение к Ф или отщепление от него небольшого структурного фрагмента, сопровождающееся значительным изменением активности катализатора. Примером может служить инактивация гликогенсин- тетазы после присоединения фосфатной группы к одному из сери- новых остатков. Ф восстанавливает свою активность после отщепления фосфата.
В поиске БАВ с целью создания новых JIC особое значение приобретает выбор стратегии конструирования ИФ [9]. Различают две основные категории — обратимые и необратимые ИФ. Обратимые обычно связываются с Ф посредством нековалентных или слабых ко- валентных связей и могут быть удалены разбавлением, гелевой фильтрацией или диализом. При этом каталитическая активность Ф восстанавливается. Степень ингибирования при обратимом связывании зависит от концентрации Ф и ингибитора. Необратимые ИФ связываются с Ф ковалентно и не могут быть удалены указанными выше способами, а степень ингибирования зависит от времени. Условность этой классификации становится очевидной, если учесть, что существуют мощные обратимые ИФ, связывающиеся нековалентно, но чрезвычайно медленно диссоциирующие. В то же время такая классификация полезна для описания многих систем Ф-ИФ.
Необратимые ингибиторы ферментов
Процесс необратимого ингибирования можно представить следующим образом: E + I >Е1. При этом между активным центром Е и ингибитором I имеет место реакция второго порядка с образованием неактивного стабильного производного EI. Очевидно, что в присутствии ИФ образование продукта Р в реакции, катализируемой Е, приостанавливается: Если первоначальная концентрация Е выше, чем I, то по окончании связывания Ф с ИФ синтез Р возобновляется. Ковалентное связывание Е с I используется для получения «меченых» Ф, например, алкилированием in vitro тиопротеаз с помощью иодуксусной кислоты: Необратимым связыванием с ацетилхолинэстеразой объясняется токсическое действие фосфорорганических соединений, относящихся к категории боевых отравляющих веществ (зарин, зоман и др.) или пестицидов. Эти соединения, фосфорилируя активный центр указанного Ф, блокируют ферментативный гидролиз ацетилхолина в местах соединения нейронов (синапсах). В результате прекращается передача нервных импульсов в ЦНС животных и человека. Однако необратимое связывание далеко не всегда сопряжено только с токсическим эффектом. Необратимые ИФ широко представлены в современном арсенале JIC [9]. Так, механизм действия антибиотиков пеницил- линового и цефалоспоринового ряда основан на необратимом связывании Ф с транспептидазой, трансгликозилазой и D-аланин- карбоксикиназой. Эти ф участвуют на заключительных этапах синтеза гликопептидов, образующих стенки бактериальной клетки. р-Лактамное кольцо как пенициллинов, так и цефалоспори- нов, раскрываясь, ацилирует образующий Ф протеин, возле активного центра [9—11]. Пенициллин — природное соединение, продуцируемое плесневым грибом Penicillium notatum, был открыт в 1928 г. A. Fleming (Великобритания). До открытия этого вещества р-лакгамное кольцо как химическая структура не было известно. Легкость гидролитического расщепления, обусловленная нестабильностью напряженного четырехчленного цикла, не позволила A. Fleming начать клиническое применение пенициллина, хотя антибиотик проявил высокую эффективность при испытаниях in vitro. Позднее, в годы Второй мировой войны, в США (сверхсекретный англоамериканский проект) строение пенициллина было подтверждено данными РСИ. Оказалось, что бициклическая структура образована двумя аминокислотными остатками цис теина и вали на: Полный синтез пенициллинов осуществлен в 1953 г. С тех пор получено большое количество как синтетических, так и полусинтетических производных этого ряда. Доступности последних в значительной мере способствовало получение 6-аминопенициллиновой кислоты (5.31) в процессе ферментации природных продуктов.
Первые указания на возможный механизм действия пенициллина появились в 1957 г., когда Laderberg обнаружил, что чувствительные к этому антибиотику бактерии могут расти в его присутствии в том случае, если находятся в форме протопластов, т. е. лишены клеточной стенки. В 1965 г. Park и Strominger показали, что пенициллин препятствует образованию сшивок на заключительном этапе синтеза клеточной стенки у бактерий [10]. Структуры наиболее распространенных препаратов пенициллино- вого и цефалоспоринового ряда приведены в табл. 5.1. Все эти вещества обладают широким спектром антибактериального действия, главным образом, против грамположительных инфекций. Самым существенным недостатком р-лактамных антибиотиков остается развивающаяся к ним резистентность микроорганизмов. Причина кроется в наличии у бактерий Ф — р-лактамаз (пени- циллиназ), гидролизующих р-лактамное кольцо и превращающих JIB в неактивную пенициллиновую кислоту. Грамположительные бактерии экскретируют р-лактамазы в окружающую среду и таким образом разрушают антибиотик до его проникновения в бактериальную клетку. Грамотрицательные бактерии содержат р-лактамазы внутри клетки. Тем не менее, метод повышения устойчивости антибиотиков пенициллинового ряда был найден, и он представляет собой еще один пример необратимого ингибирования. Ингибиторами пенициллиназ выступают сульфон (5.32) и клаву- лановая кислота (5.33). Механизм реакции с участием клавулановой кислоты можно представить следующим образом: Ингибиторы р-лактамаз используются в комбинации с антибиотиками для повышения их стабильности при создании ЛФ. Кроме того, ряд веществ, в силу особенностей их строения, обладает повышенной стабильностью относительно кислотного гидролиза, алкоголиза и действия ионов Zn2+, Cu2+, Pb24. К их числу принадлежат феноксиметилпроизводное пенициллина и большинство полусинтетических антибиотиков [10, И].
Более широким спектром бактерицидного действия и повышенной стабильностью обладают цефалоспорины, открытые в 50-е гг. В основе их химического строения лежит 7-аминоцефалоспориновая кислота. Первый антибиотик этой группы — цефалоспорин С — был выделен из культуры Cephalosporium acremonium. Соединения данного ряда также являются необратимыми ингибиторами транс пептид аз. Резистентные в отношении (3-лактамаз грамположительных бактерий, цефалоспорины подвержены разрушению хромосомными лактамазами грамотрицательных микроорганизмов. Для повышения их устойчивости, расширения спектра антимикробного действия, улучшения фармакокинетических показателей получены многочисленные полусинтетические аналоги цефалоспорина С. Существует четыре поколения препаратов этого ряда. Приведенный в табл. 5.1 клафоран относится к третьему, а цефметазон — к четвертому из них [9—11].
Известные противоопухолевые средства — 5-фторурацил (5.34) и фторафур (5.35) — сочетают в себе свойства антиметаболитов (см. разд. 6) и необратимых ИФ. Эти соединения связываются с ти- мидилат синтетазой, которая катализирует перенос одноуглеродного остатка от метилентетрагидрофолата (см. разд. 5.1.2) к дезоксиури- динмонофосфату, на пути превращения последнего в тимидинмоно- нуклеотид. Угнетение синтеза тимидина тормозит быстрое деление опухолевых клеток. Первоначально предполагалось, что фторзамещенные урацила выступают в качестве конкурентных ингибиторов тимидилат синтетазы. Однако более поздние исследования показали, что эти соединения мимикрируют переходное состояние E-S, ковалентно связываясь с Ф и THF. В результате реакция не может завершиться природным путем из-за необратимого связывания всех веществ, участвующих в данном процессе [12]. Угнетение синтеза тимидина происходит до тех пор, пока в системе присутствуют (5.34) или (5.35). Для возобновления нормального течения биохимического процесса необходимо воспроизводство новых порций Ф. К сожалению, нарушение продукции тимидина под действием фторпроизводных урацила отмечается не только в опухолевых, но и во всех быстро делящихся клетках (костный мозг, кишечный эпителий). Этим объясняется большое количество побочных эффектов, связанных с применением данных препаратов. К категории необратимых ИФ, способных мимикрировать переходное состояние E-S, относится и высоко аффинный ингибитор аденозиндезаминазы — антибиотик коформицин (5.36). Он препятствует основно катализируемому присоединению воды к аденози- ну (5.37) на пути его превращения в инозин (5.38). Равновесие при взаимодействии (5.36) с Ф достигается очень медленно в течение секунд или минут (вместо миллисекунд). Образующийся комплекс E-I очень устойчив (Т1/2= 40 ч), главным образом, за счет перехода в состояние E-I*, близкое по структуре к E-S. Превращения можно представить в виде следующей схемы: При значении стремящемся к нулю, ингибирование становится практически необратимым. Кроме того, E-I* не находится в состоянии равновесия с субстратом, и он не может разрушить этот комплекс [13]. Рассматривая различные категории ИФ, невозможно обойти вниманием такую обширную группу JTС как нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Механизм действия НПВС (сали- цилаты, ибупрофен (2.46), вольтарен (5.39), индометацин (5.40), напроксен (5.41), пироксикам (5.42), кетопрофен (5.43), мефенамо- вая кислота (5.44), бугадион (5.45), анальгин (5.46) и др.) связан, главным образом, с ингибированием простагландинсинтетазы (PGH-синтетаза).
PGH-синтетаза (циклооксигеназа) участвует на начальных этапах превращения арахидоновой кислоты (5.47) в эндопероксид PGG2 и простаг- ландин PGHr Далее из PGH2 в результате реализации каскада энзимати- ческих реакций образуется большое количество физиологических посредников — простагландинов (рис. 5.6). Несмотря на то, что указанные соединения подвергаются быстрой ферментативной деградации, их роль в течении физиологических и патологических процессов в организме чрезвычайно велика. Так, PGE2 стимулирует гладкую мускулатуру ПК и мио- метрия, угнетает желудочную секрецию, способствует повышению температуры тела, выступает в качестве медиатора боли, обладает вазо- и бронходилататорным эффектами. PGF2 и PGD2, напротив, вызывают брон- хоспазм и вазоконстрикцию. Мощным вазоконстрикгором является и тром- боксан ТхА который также несет ответственность за тромбообразование в сосудах. Его метаболит – ТхВ2 — неактивен. Простациклин PGI2 препятствует агрегации тромбоцитов. Баланс между проста цикли ном и тромбоксаном играет важную роль в обеспечении гемостатического равновесия. PGI, обладает вазодилататорным и гипотензивным эффектами. Еще один вид посредников — лейкотриены (LT) — образуются из арахидо- новой кислоты под действием липоксигеназы, глутатионтрансферазы и др. Ф. LTB4 несет ответственность за проявление симптомов воспалительного процесса: вызывает скопление лейкоцитов в очаге воспаления и отек тканей. Повышенный уровень LTB4 отмечается при таких заболеваниях как ревматоидный артрит, язвенный колит, бронхиальная астма. LTC, и LTD4 вызывают бронхоспазм, обладают выраженным гипотензивным эффектом. Таким образом, фармакологическое вмешательство в синтез простагландинов влечет за собой большое количество как положительных, так и отрицательных эффектов [14, 15]. Ингибирование PGH-синтетазы обусловливает проявление у НПВС анальгетического, противовоспалительного, жаропонижающего действия. В то же время снижение продукции простагландинов приводит к побочным эффектам, связанным со стимуляцией эрозивно-язвен- ных процессов в ПК. Опасным осложнением применения НПВС является бронхоспазм: блокада синтеза простагландинов может вызвать сдвиг метаболизма арахидоновой кислоты в сторону избыточной продукции лейкотриенов, что влечет за собой отек тканей и спазм гладкой мускулатуры бронхов [16]. Большинство НПВС относятся к категории обратимых ингибиторов PGH-синтетазы. Необратимым ИФ является ацетилсалициловая кислота (аспирин). Аспирин, связываясь с Ф, ацилирует гидроксиль- ную группу в остатке серина, расположенном в локусе адсорбции арахидоновой кислоты. Скорость инактивации Ф увеличивается с ростом концентрации аспирина [8].
Добавить комментарий