Обсуждая проблемы регуляции ферментативной активности, нельзя не коснуться способов ингибирования в мультиферментных системах, в которых субстрат претерпевает несколько последовательных превращений, и каждая реакция катализируется своим Ф. Скорость образования конечного продукта в таком каскаде определяется скоростью самой медленно текущей – лимитирующей реакции. Ф, катализирующий такую реакцию, называется регуляторным. В мультиферментных системах на активность регуляторного Ф влияет концентрация конечного продукта в каскаде превращений по принципу отрицательной обратной связи: Такая система функционирует следующим образом: когда концентрация продукта F превышает потребности клетки, наблюдается ингибирование регуляторного Ф, в результате чего скорость процесса падает, и концентрация вещества F приходит в соответствие с потребностями биологической системы.
При этом продукт F должен быть либо структурно близок к субстрату регуляторного Ф ( на схеме это субстрат А), т. е. действовать как конкурентный ингибитор, либо связываться не с активным центром этого Ф, иными словами, выступать в роли неконкурентного ингибитора. Возможность ингибирования Ф продуктами его взаимодействия с соответствующим субстратом чрезвычайно важна в плане конструирования новых ЛС: если имеется информация о наличии регуляторного Ф на какой-либо стадии метаболизма и есть необходимость в поиске его ингибиторов, то такое исследование целесообразно проводить в ряду структурных аналогов продуктов ферментативной реакции. Один из наиболее ярких примеров такого направления в конструировании лекарств — поиск ингибиторов ангиотензин-превращающего Ф (АПФ), завершившийся созданием новых антигипертензивных препаратов — каптоприла, эналапри- ла и др. Система ренин-ангиотензин-альдостерон является многофакторно регулируемым каскадом ферментативно опосредованных превращений, в котором гликопептид ангиотензиноген (ключевая аминокислотная последовательность: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His- ангиотензин III (AIII). Тем самым обеспечивается главный механизм контроля АД млекопитающих (рис. 5.8). Установление последовательности этих превращений натолкнуло исследователей на мысль, что эффективно снижать АД можно путем блокирования накопления АН, ингибируя ренин или АПФ. Созданию препаратов, по механизму действия являющихся ингибиторами АПФ, предшествовал ряд исследований. В начале XX в. был обнаружен белок плазмы крови, вызывающий повышение тонуса гладкой мускулатуры кровеносных сосудов — агиотензино- ген. В 1934 г. установлено, что ангиотензиноген под действием фермента ренина превращается в другой пептид — ангиотензин. К 1950 г. было показано, что первой ступенью ферментативного расщепления ангиотен- зиногена является декапептид AI, мало влияющий на сосудистое сопротивление и АД. Под влиянием АПФ AI превращается в АН — октапептиц, обладающий сильной сосудосуживающей и прессорной активностью. Изучение свойств All позволило установить, что этот пептид связывается со специфическими рецепторами АТП стенок кровеносных сосудов и вызывает быстрое и длительное повышение АД. Кроме того, он стимулирует секрецию альцостерона, а в больших дозах — и секрецию антидиуретического гормона гипофиза, что сопровождается реабсорбцией ионов натрия и воды и развитием гиперволемии. Таким образом, в результате многолетних исследований стало очевидным, что ренин-аншотензиновый каскад играет важную роль в патогенезе гипертензии, что и явилось теоретической основой для поиска препаратов, обеспечивающих новый подход в лечении этого заболевания [18—24].
Принципиально существуют четыре возможности для снижения АД путем воздействия на ренин-ангиотензиновый каскад: • ингибирование образования ренина; • ингибирование образования ангиотензиноген а; • ингибирование образования или активности АПФ; • блокада ангиотензиновых АТн-рецепторов. До недавнего времени наиболее результативным было создание ингибиторов АПФ. В настоящее время активно развивается поиск блокаторов АТИ-рецепторов и ингибиторов ренина. Ангиотензин II (октапептид) | (ангиотензиназа Ангиотензин III (гептапептид) стимуляция секреции альдостерона Первоначально поиск ингибиторов АПФ изобиловал случайными находками по причине отсутствия сведений о структуре активного центра этого Ф. Так, в 1960 г. было обнаружено, что способностью ингибировать АПФ обладает яд бразильской змеи, из которого был выделен пептид телротид (руго Glu – Tip-Pro-Ат% – Pro- Glu – II е – Pro-Pro – ОН).
В 1971 г. осуществлен синтез этого пептида, но практического применения это вещество не получило. В то же время стало понятно, что направленный поиск субстратоподобных ингибиторов АПФ следует вести среди пептидов близких по аминокислотному составу к тепро- тиду или А1. С 1970 по 1974 гг. с этой целью было получено и исследовано около 4000 соединений. Ключевую гипотезу в создании АПФ выдвинули М. Ondetti и D. Cushman, предположив, что АПФ принадлежит к числу металлопротеиназ и подобен карбоксипептида- зе А [19, 20]. Ингибиторы последней были модифицированы и на их основе получены вещества, способные связывать АПФ. В виду отсутствия точных данных о строении активного центра Ф, предположили, что для его эффективного блокирования необходимым условием является наличие у ИФ групп, способных координировать ионы Zn2+ и тем самым препятствовать их каталитической функции в процессе гидратации. Действительно, неспецифическими ингибиторами АПФ являются ЭДТА, 0-фенантролин, а,а-дипиридил, способные образовывать устойчивые комплексы с ионами Zn2+. Объединение идеи подбора субстратоподобных ингибиторов с гипотезой о хелатировании Zn2+ послужило новым толчком в конструировании АПФ. Из приведенных в табл. 5.2 данных можно составить представление о том, как происходил отбор и модификация веществ с рассматриваемой активностью. В базовой структуре (5.58) наращивание боковой цепи от концевой карбоксильной группы за счет метиленовых фрагментов привело к росту ингибирующей активности, но при п=4 активность резко снизилась. Следующий шаг был связан с изомеризацией цепи. Введение в а-положение по отношению к амидной группе метального радикала способствовало значительному росту активности. Замена карбоксильной группы на тиольную привела к кап- топрилу (5.59). В его структуре присутствует фрагмент пролина, который входит в состав пептида тепротида, а также ангиотензи- нов. Стереохимия этого фрагмента является решающим фактором для проявления активности: замена его на </-пролин приводит к снижению эффекта в 104 раз [21—24]. Вслед за каптоприлом был создан целый ряд синтетических ингибиторов АПФ, в том числе эналаприл (5.60), лизиноприл (5.61), рамиприл (5.62). Установлено, что эналаприл является пролекарством, превращающимся в организме в активный энаприлат [25]. В последнее время получены не содержащие аминокислотных остатков синтетические ингибиторы АПФ — цилазаприл (5.63) и др. Следует отметить, что, несмотря на высокую эффективность и большой коммерческий успех, эти препараты не лишены некоторых побочных эффектов (отек, кашель), что связано с низкой селективностью АПФ. Этот Ф (дипептидилкарбоксипептидаза) инактивирует брадикинин и ряд др. эндогенных субстратов (см. рис.5.8). Ингиби- рование АПФ приводит к их накоплению и проявлению нежелательных побочных эффектов [13, 26]. По этой причине более обнадеживающим является направление, связанное с разработкой блокаторов АТН — рецепторов и ингибиторов ренина. Первым блокатором АТп-рецепторов стал саралазин — пептидное соединение, близкое по структуре к АН и являющееся его конкурентным антагонистом. Он имеет следующую аминокислотную последовательность: CH3-NH-CH2~CO-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-AIa-COOH. Однако практического применения саралазин не получил в основном из-за сложности синтеза и неэффективности при пероральном применении. В начале 90-х гг создан непептидный синтетический блока- тор АТ„-рецепторов — лозартан (5.64). Ренин — фермент, который является первым в каскаде превращений, регулирующих АД. Он специфичен, принадлежит к группе аспартилпротеиназ и в этом смысле близок к пепсину и катепсину Д. Недавние рентгено-структурные исследования рекомбинантного человеческого ренина подтвердили наличие в его активном центре двух карбоксильных групп аспартатного фрагмента, между которыми может разместиться достаточно объемный пептидный субстрат, содержащий до 8 аминокислотных остатков [27, 28]. Ионизированная форма одной из карбоксильных групп выступает в качестве общего основания и катализирует атаку молекулы воды на амидную группу в субстрате. В то же время, вторая карбоксильная группа является протонодонором и участвует в образовании тетраэд- рического промежуточного продукта. В отличие от АПФ, активный центр ренина не содержит ионов цинка. Это означает, что взаимодействие осуществляется за счет гидрофобных контактов фермента с боковыми цепями аминокислотных остатков. Наиболее привлекательным для специалистов является путь поиска высоко аффинных химически стабильных ингибиторов, которые воспроизводят ге
Добавить комментарий